1、實驗部分

1.1儀器和(he)試(shi)劑

SpectraMax M5型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；MB100-4A型微孔板恒溫震蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；ZHLY-180型立式恒溫振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司）；Sigma 3K15型臺式高速冷凍離心機（德國希格瑪公司）；ProFlex型PCR儀（美國賽默飛公司）；DV-ⅢULTRA型粘度計（美國Brookfield公司）；旋轉滴法界面張力儀（芬蘭(lan)Kibron公司）；EZ-Pi Plus便攜式(shi)動態表面張力儀(yi)（芬蘭(lan)Kibron公司）。

瓜爾(er)膠(jiao)為工業(ye)級，由(you)長慶鈺宸公司(si)提供；葡(pu)萄(tao)糖、NaCl、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、NH4NO3、CuSO4、Na2MoO4·2H2O、FeSO4·7H2O、KCl、CaCl2、MnCl2·4H2O、D-?甘(gan)露糖和3，?5-?二硝基水(shui)楊酸（3，?5-Dinitrosalicylic acid，DNS）均(jun)為分析純試劑；胰蛋(dan)(dan)白胨、大豆蛋(dan)(dan)白胨、酵(jiao)母(mu)粉(fen)、蛋(dan)(dan)白胨、植物凝膠(jiao)和瓊脂均(jun)為生(sheng)(sheng)物試劑；細菌基因組DNA抽提試劑盒購買于(yu)德國凱杰(jie)QIAGEN公司(si)；細菌16S rRNA基因通用引物8F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和805R（5'-GACTACCAGGGTATCTAATC-3'）由(you)南京金斯瑞生(sheng)(sheng)物科技股份有限公司(si)合成。

1.2實驗方法

1.2.1樣品來源(yuan)與(yu)培養基

本實驗(yan)所(suo)用的水樣(yang)是(shi)由長慶油田(tian)(tian)提(ti)供(gong)的壓裂液(ye)返排水，土(tu)樣(yang)采自云南省(sheng)楚雄市(shi)魔芋生產田(tian)(tian)地。

富集培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)：胰蛋白(bai)(bai)胨(dong)15.0 g/L、大豆蛋白(bai)(bai)胨(dong)5.0 g/L、酵(jiao)母(mu)(mu)(mu)粉2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L、NaCl 5.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L；固體初篩培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)：瓜爾(er)膠(jiao)10.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、Na2HPO4 4.0 g/L、MgSO4 0.2 g/L、植(zhi)物凝(ning)膠(jiao)15.0 g/L、NH4NO3 1.0 g/L；復篩培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)：瓜爾(er)膠(jiao)10.0 g/L、NH4NO3 1.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、Na2HPO4 4.0 g/L、MgSO4 0.2 g/L、酵(jiao)母(mu)(mu)(mu)粉0.5 g/L、微量(liang)元素1.0%（體積(ji)分(fen)數(shu)）；發酵(jiao)產(chan)酶培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)：瓜爾(er)膠(jiao)15.0 g/L、NH4NO3 1.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、Na2HPO4 4.0 g/L、MgSO4 0.2 g/L、酵(jiao)母(mu)(mu)(mu)粉0.5 g/L、微量(liang)元素1.0%（體積(ji)分(fen)數(shu)）；微量(liang)元素配方：CuSO4 0.1 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.1 g/L、FeSO4·7H2O 2.0 g/L、CaCl2 1.0 g/L、MnCl2·4H2O 0.5 g/L；種子培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)：蛋白(bai)(bai)胨(dong)10.0 g/L、酵(jiao)母(mu)(mu)(mu)粉5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L；LB固體培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)：蛋白(bai)(bai)胨(dong)10.0 g/L、酵(jiao)母(mu)(mu)(mu)粉5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L、瓊脂(zhi)18.0 g/L。以上培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)在使用前，均在121℃高壓滅菌(jun)20 min。

1.2.2菌(jun)株(zhu)的高通量篩選(xuan)

稱取1.0 g魔(mo)芋地土樣(yang)(yang)于錐形瓶中(zhong)(zhong)（魔(mo)芋地的(de)(de)(de)(de)土壤環境適合β-甘(gan)露(lu)聚糖酶(mei)產生(sheng)(sheng)菌(jun)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)長），加入5.0 mL水(shui)樣(yang)(yang)和(he)100.0 mL蒸餾水(shui)，在(zai)(zai)37℃、180 r/min的(de)(de)(de)(de)立(li)式恒(heng)(heng)(heng)溫振蕩(dang)培(pei)養(yang)(yang)(yang)箱（搖床）中(zhong)(zhong)震蕩(dang)培(pei)養(yang)(yang)(yang)30 min，充分(fen)混勻(yun)后室溫靜置(zhi)1 h，分(fen)層(ceng)后取2.0 mL上(shang)(shang)層(ceng)清液轉(zhuan)接(jie)于200.0 mL富(fu)集培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)培(pei)養(yang)(yang)(yang)，37℃、180 r/min恒(heng)(heng)(heng)溫震蕩(dang)48 h。取200.0μL富(fu)集培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)(de)(de)菌(jun)液均勻(yun)涂布于以瓜爾(er)膠為(wei)唯一碳源的(de)(de)(de)(de)OD 90 mm（培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)直徑為(wei)90 mm）固(gu)體(ti)初篩(shai)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)上(shang)(shang)，倒置(zhi)培(pei)養(yang)(yang)(yang)60 h，之后用1.0%（質量分(fen)數(shu)）剛果紅染液染色，觀(guan)察菌(jun)落周圍有無透(tou)明(ming)圈，挑取透(tou)明(ming)圈大的(de)(de)(de)(de)單菌(jun)落轉(zhuan)接(jie)到于裝(zhuang)有2.0 mL復(fu)篩(shai)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)的(de)(de)(de)(de)96孔培(pei)養(yang)(yang)(yang)板(ban)中(zhong)(zhong)繼(ji)續(xu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)，在(zai)(zai)微孔板(ban)恒(heng)(heng)(heng)溫震蕩(dang)器中(zhong)(zhong)37℃、500 r/min震蕩(dang)培(pei)養(yang)(yang)(yang)48 h。將培(pei)養(yang)(yang)(yang)后的(de)(de)(de)(de)發酵液置(zhi)于臺式高速冷凍離心(xin)機(ji)（離心(xin)機(ji)）中(zhong)(zhong)，4℃、3000 r/min離心(xin)20 min，上(shang)(shang)清液即為(wei)粗酶(mei)液，根據瓜爾(er)膠降解情況及酶(mei)活力(li)大小(xiao)進行(xing)復(fu)篩(shai)，同時進行(xing)甘(gan)油保藏(zang)（甘(gan)油和(he)LB溶液的(de)(de)(de)(de)體(ti)積比為(wei)1∶1）。

1.2.3菌(jun)株的形態觀察及種屬鑒定

形態(tai)特征(zheng)觀(guan)(guan)察(cha)將(jiang)篩(shai)選得到的菌株接種(zhong)于(yu)種(zhong)子(zi)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基中(zhong)，37℃、180 r/min活(huo)化(hua)培(pei)(pei)養(yang)(yang)，取(qu)對數生長期菌液(ye)稀(xi)釋涂布于(yu)LB固體培(pei)(pei)養(yang)(yang)基上，37℃倒置培(pei)(pei)養(yang)(yang)，觀(guan)(guan)察(cha)菌落的形態(tai)特征(zheng)。采(cai)用革蘭(lan)氏染色法，在顯(xian)微(wei)鏡下(xia)觀(guan)(guan)察(cha)菌體結構，并通過掃(sao)描電子(zi)顯(xian)微(wei)鏡觀(guan)(guan)察(cha)菌體形態(tai)及大(da)小。

分子(zi)生物(wu)學鑒定按(an)照細(xi)菌基因組DNA抽提試劑(ji)盒說明書進(jin)行(xing)(xing)DNA的(de)提取，以基因組DNA為模版，采用(yong)細(xi)菌的(de)通用(yong)引物(wu)8F和805R進(jin)行(xing)(xing)PCR（聚合(he)酶鏈式反應）擴增。對PCR產物(wu)進(jin)行(xing)(xing)瓊(qiong)脂糖凝膠電泳檢(jian)測(ce)后，送至上(shang)海(hai)華大基因科技有限公司測(ce)序。將測(ce)序結果在(zai)NCBI數據庫中（http：//www.ncbi.nlm.gov/blast/）進(jin)行(xing)(xing)BLAST同源性比(bi)對（BLAST是在(zai)NCBI數據庫中進(jin)行(xing)(xing)相似性分析(xi)的(de)工具），并利用(yong)MEGA軟件的(de)N-J法構(gou)建(jian)系統發育進(jin)化(hua)樹。

1.2.4酶活力(li)的測定(ding)

采用(yong)3，5-二硝基水(shui)楊酸法對β-甘(gan)露(lu)聚糖(tang)(tang)酶(mei)(mei)(mei)(mei)酶(mei)(mei)(mei)(mei)活(huo)(huo)力進行測(ce)定(ding)，用(yong)pH=7.0的(de)(de)(de)PBS緩(huan)(huan)沖液(ye)（每100 mL PBS緩(huan)(huan)沖液(ye)由38 mL 0.2 mol/L的(de)(de)(de)Na2HPO4和(he)62 mL 0.2 mol/L的(de)(de)(de)KH2PO4配成）配制0.5%（質量(liang)分數）的(de)(de)(de)瓜爾膠底(di)物溶液(ye)。反(fan)(fan)應體系包(bao)含(han)50.0μL粗酶(mei)(mei)(mei)(mei)液(ye)和(he)450.0μL的(de)(de)(de)瓜爾膠底(di)物溶液(ye)，50℃反(fan)(fan)應10 min后，加(jia)入1.0 mL的(de)(de)(de)DNS試劑終止反(fan)(fan)應，沸水(shui)浴10 min顯色后，立刻(ke)冰水(shui)浴冷(leng)卻至室溫(wen)。取(qu)200.0μL反(fan)(fan)應液(ye)轉移至96孔(kong)板中，在(zai)540 nm處(chu)用(yong)多功(gong)能酶(mei)(mei)(mei)(mei)標儀測(ce)定(ding)吸光度，實驗每組設(she)置3個平行，結(jie)果(guo)取(qu)平均值。以不同濃度D-甘(gan)露(lu)糖(tang)(tang)為(wei)(wei)標準(zhun)品制作標準(zhun)曲(qu)線，并根據標準(zhun)曲(qu)線計(ji)算產(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)還原糖(tang)(tang)量(liang)。在(zai)一定(ding)溫(wen)度和(he)pH值條件下(xia)，1 min催化底(di)物水(shui)解產(chan)生(sheng)1.0μmol相當(dang)于D-甘(gan)露(lu)糖(tang)(tang)的(de)(de)(de)還原糖(tang)(tang)所需要(yao)的(de)(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)(mei)量(liang)，定(ding)義為(wei)(wei)1.0個酶(mei)(mei)(mei)(mei)活(huo)(huo)力單位。采用(yong)Bradford法測(ce)定(ding)蛋白質濃度，比(bi)活(huo)(huo)的(de)(de)(de)定(ding)義為(wei)(wei)：每毫克酶(mei)(mei)(mei)(mei)蛋白所具有的(de)(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)(mei)活(huo)(huo)力。

1.2.5酶學性質表征

粗(cu)酶液(ye)的制備在無菌環境下(xia)將(jiang)篩選(xuan)得到的菌株接種到種子培養(yang)基中，37℃、180 r/min活(huo)化培養(yang)24 h，按5.0%的接種量(liang)轉接到發(fa)酵產酶培養(yang)基中，37℃、180 r/min搖床培養(yang)72 h，將(jiang)發(fa)酵液(ye)于(yu)4℃下(xia)，9000 r/min離心20 min，收集(ji)上(shang)清液(ye)，上(shang)清液(ye)即(ji)為粗(cu)酶液(ye)，于(yu)4℃冰(bing)箱冷(leng)藏備用。

最適溫(wen)度(du)(du)按(an)照1.2.4小節(jie)的(de)方法分別(bie)在(zai)不(bu)同(tong)溫(wen)度(du)(du)：5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90和(he)100℃下(xia)(xia)反(fan)應，測定β-甘露聚糖酶活力。以未(wei)經處理的(de)同(tong)溫(wen)度(du)(du)下(xia)(xia)的(de)瓜爾膠底物溶液(ye)作為空(kong)白(bai)對照。以最適溫(wen)度(du)(du)下(xia)(xia)的(de)酶活力為100%，計算不(bu)同(tong)溫(wen)度(du)(du)下(xia)(xia)的(de)相對酶活力。實驗每組設置3個平行樣，結果取平均值（下(xia)(xia)同(tong)）。

最適(shi)(shi)pH值(zhi)分別用pH值(zhi)為(wei)2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的(de)緩沖液(ye)(ye)配制0.5%（質量分數）瓜(gua)爾(er)膠底物(wu)溶液(ye)(ye)，按照1.2.4小節(jie)的(de)方法在最適(shi)(shi)溫度下測定(ding)β-甘露聚糖酶(mei)(mei)(mei)活力。以(yi)未(wei)經(jing)處理(li)的(de)相(xiang)同(tong)(tong)pH值(zhi)的(de)瓜(gua)爾(er)膠底物(wu)溶液(ye)(ye)作為(wei)空白對(dui)照。以(yi)最適(shi)(shi)pH值(zhi)下的(de)酶(mei)(mei)(mei)活力為(wei)100%，計算不同(tong)(tong)pH值(zhi)下的(de)相(xiang)對(dui)酶(mei)(mei)(mei)活力。

熱穩(wen)定(ding)性將粗酶(mei)(mei)(mei)液分別(bie)在60、70和80℃的(de)恒(heng)溫水浴中孵(fu)育(yu)1 h，孵(fu)育(yu)期間每(mei)隔10 min取50.0μL該粗酶(mei)(mei)(mei)液加(jia)入瓜爾膠底物溶液中，按照1.2.4小(xiao)節的(de)方法在最適反(fan)應(ying)條件下測定(ding)β-甘(gan)露聚糖酶(mei)(mei)(mei)的(de)殘余(yu)活力，以評價酶(mei)(mei)(mei)的(de)熱穩(wen)定(ding)性。

pH值(zhi)穩定(ding)性(xing)將粗(cu)酶(mei)液(ye)(ye)(ye)分別在(zai)pH值(zhi)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的(de)緩(huan)沖液(ye)(ye)(ye)中孵(fu)育(yu)2 h，孵(fu)育(yu)期間每隔20 min取(qu)50.0μL該粗(cu)酶(mei)液(ye)(ye)(ye)加入瓜爾膠底物溶液(ye)(ye)(ye)混勻。按(an)照(zhao)1.2.4小(xiao)節的(de)方法在(zai)最適條件下測定(ding)β-甘露聚糖酶(mei)的(de)殘余(yu)活力，以(yi)評價(jia)酶(mei)的(de)pH值(zhi)穩定(ding)性(xing)。

1.2.6低溫降解瓜爾膠

配制(zhi)0.8%（質(zhi)量(liang)分數）的(de)(de)瓜(gua)(gua)(gua)爾膠(jiao)(jiao)(jiao)底物溶液(ye)(ye)(ye)，加入1.0%（體(ti)積(ji)分數）的(de)(de)粗酶液(ye)(ye)(ye)，分別在5和20℃下恒溫(wen)(wen)水浴(yu)，測(ce)(ce)定不同作用時(shi)間下瓜(gua)(gua)(gua)爾膠(jiao)(jiao)(jiao)溶液(ye)(ye)(ye)的(de)(de)粘(zhan)度變化，每次測(ce)(ce)量(liang)3次取(qu)平均(jun)值(zhi)。以未經(jing)處(chu)理的(de)(de)瓜(gua)(gua)(gua)爾膠(jiao)(jiao)(jiao)溶液(ye)(ye)(ye)作為空白(bai)對照，評價反應溫(wen)(wen)度為5和20℃時(shi)，β-甘露聚糖酶對瓜(gua)(gua)(gua)爾膠(jiao)(jiao)(jiao)的(de)(de)降(jiang)粘(zhan)效果。降(jiang)粘(zhan)率（Viscosity Reduction Rate，VRR）的(de)(de)計算如公式（1）所示：

式中，μ0為(wei)降粘(zhan)前(qian)的粘(zhan)度（mPa?s），μ1為(wei)降粘(zhan)后粘(zhan)度（mPa?s）。

1.2.7破膠性(xing)能評價

壓(ya)裂液(ye)的配(pei)制(zhi)按照國標SY/T 5107-2016《水基(ji)壓(ya)裂液(ye)性能(neng)評價方(fang)法(fa)》中壓(ya)裂液(ye)試樣制(zhi)備方(fang)法(fa)制(zhi)備壓(ya)裂液(ye)。壓(ya)裂液(ye)配(pei)方(fang)為：基(ji)液(ye)：0.35%（質(zhi)(zhi)量(liang)(liang)分(fen)(fen)數(shu)）瓜爾(er)膠、1.0%（質(zhi)(zhi)量(liang)(liang)分(fen)(fen)數(shu)）KCl、0.1%（質(zhi)(zhi)量(liang)(liang)分(fen)(fen)數(shu)）殺(sha)菌劑(ji)、0.18%（質(zhi)(zhi)量(liang)(liang)分(fen)(fen)數(shu)）Na2CO3、0.036%（質(zhi)(zhi)量(liang)(liang)分(fen)(fen)數(shu)）NaHCO3；交(jiao)聯(lian)液(ye)：1.0%（體積分(fen)(fen)數(shu)）硼(peng)砂溶液(ye)，交(jiao)聯(lian)劑(ji)比(bi)為100∶5（體積比(bi)）；酶破膠劑(ji)：1.0%（體積分(fen)(fen)數(shu)）。

粘(zhan)度(du)的(de)測(ce)定按(an)配方配制壓(ya)裂液，將加入酶破(po)膠(jiao)(jiao)劑的(de)凍膠(jiao)(jiao)分別置于5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80和90℃的(de)恒(heng)溫(wen)(wen)水浴中，在破(po)膠(jiao)(jiao)3和6 h時取其上層清(qing)液，于室(shi)溫(wen)(wen)下(xia)(xia)用粘(zhan)度(du)計測(ce)定破(po)膠(jiao)(jiao)液的(de)粘(zhan)度(du)，每次測(ce)量3次取平均值（下(xia)(xia)同）。

表面(mian)(mian)(mian)(mian)張(zhang)(zhang)力(li)(li)和(he)(he)界面(mian)(mian)(mian)(mian)張(zhang)(zhang)力(li)(li)的測(ce)(ce)定待壓裂(lie)液交聯后，加入(ru)(ru)酶破膠劑，分別在10、20和(he)(he)50℃的恒(heng)溫水浴中破膠3 h，待破膠液的粘度降(jiang)低到5 mPa·s以(yi)下后，將破膠液倒(dao)入(ru)(ru)燒杯中，用(yong)表面(mian)(mian)(mian)(mian)張(zhang)(zhang)力(li)(li)儀(yi)測(ce)(ce)定破膠液的表面(mian)(mian)(mian)(mian)張(zhang)(zhang)力(li)(li)，用(yong)界面(mian)(mian)(mian)(mian)張(zhang)(zhang)力(li)(li)儀(yi)測(ce)(ce)定破膠液與煤油界面(mian)(mian)(mian)(mian)張(zhang)(zhang)力(li)(li)，測(ce)(ce)試溫度為50℃。

殘(can)渣量(liang)的(de)測(ce)定按(an)照國標(biao)SY/T 5107-2016《水(shui)基壓(ya)裂(lie)液(ye)性能評(ping)價方法(fa)》中指出(chu)的(de)殘(can)渣量(liang)的(de)檢測(ce)方法(fa)進行測(ce)定。制備(bei)定量(liang)體積V0的(de)壓(ya)裂(lie)液(ye)凍膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)，加入(ru)(ru)酶破(po)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)劑(ji)，分(fen)別置于10、20和50℃的(de)恒溫(wen)水(shui)浴中破(po)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)。室溫(wen)測(ce)定破(po)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)液(ye)粘度(du)低于5 mPa·s時(shi)視為(wei)徹(che)(che)底(di)破(po)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)。將徹(che)(che)底(di)破(po)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)后(hou)的(de)溶液(ye)全部轉移到(dao)已經烘干(gan)(gan)稱重(zhong)的(de)離(li)心(xin)(xin)管中（質(zhi)量(liang)記為(wei)m0），在離(li)心(xin)(xin)機中5000 r/min離(li)心(xin)(xin)30 min，慢(man)慢(man)倒(dao)出(chu)上(shang)層清(qing)(qing)液(ye)，然后(hou)用蒸餾水(shui)清(qing)(qing)洗(xi)破(po)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)容器后(hou)倒(dao)入(ru)(ru)離(li)心(xin)(xin)管中，再次(ci)離(li)心(xin)(xin)20 min并倒(dao)出(chu)上(shang)層清(qing)(qing)液(ye)。將離(li)心(xin)(xin)管放入(ru)(ru)干(gan)(gan)燥箱中105℃下烘干(gan)(gan)至恒重(zhong)（質(zhi)量(liang)記為(wei)m1）。壓(ya)裂(lie)液(ye)殘(can)渣含量(liang)計算如公式（2）所(suo)示：

式中，η為壓(ya)裂液殘渣質量(liang)濃度（mg/L）；（m1-m0）為殘渣質量(liang)（mg）；V0為壓(ya)裂液用量(liang)（mL）。

產低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——摘要

產低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——實驗部分

產低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——結果與討論、結論