2、結果與討論

2.1β-甘露聚糖酶產生菌的篩選

 以瓜爾膠為唯一碳源，不能利用瓜爾膠產生β-甘露聚糖酶的菌株就逐漸成為弱勢菌群從而被淘汰。利用高通量篩選方法從樣品中共篩選得到571株產β-甘露聚糖酶菌株，通過DNS法分別測定其所產β-甘露聚糖酶的酶活力，測定結果如表1所示，其中有40株菌株所產酶的酶活力較高。對這40株菌株進行100 mL體系擴大培養，分別在5和20℃下測定瓜爾膠溶液的粘度，發現其中6株菌株所產酶的低溫降粘速度較快，分別編號為A2、O5、L10、H13、Q12和Q14，如圖1所示。綜上可知，菌株O5所產β-甘露聚糖酶的酶活力最高，達到208.9 U/mL；在5和20℃下降低瓜爾膠的粘度也是最快的。菌株O5經剛果紅染色后，產生了明顯的透明圈（圖2A）；經100 mL體系發酵培養48 h后，可將1%（質量分數）的瓜爾膠幾乎降解完全，培養基的粘度明顯降低，從815.8 mPa?s降低至67.2 mPa·s，降粘率大于90%（圖2B），說明其中必然存在著降解瓜爾膠的微生物。因此，進一步對菌株O5進行形態觀察和種屬鑒定及后續研究。

表1已分離的40株菌所產β-甘露聚糖酶的酶活力

圖1不同時間下瓜爾膠溶液的粘度

圖2菌株O5的剛果紅染色（A）及降解瓜爾膠特性（B）

2.2菌株O5的鑒定

 形態學鑒定如圖3所示，菌株O5在LB平板上呈灰綠色，表面光滑隆起，邊緣不整齊；革蘭氏染色鑒定為陰性；經掃描電子顯微鏡觀察得，菌株O5為桿狀菌，菌體長為1.5~2.0μm，寬為0.3~0.4μm。

圖3菌株O5的形態學觀察

 利用16S rRNA基因測序對菌株O5進行鑒定，將測序結果通過NCBI數據庫中的BLAST進行比對分析，發現菌株O5與假單胞菌的同源性最高，為99.87%。利用MEGA軟件構建系統發育樹（圖4）。由圖4可知，菌株O5和施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri M16-9-4位于進化樹的同一分支中，親緣關系最相近。綜合形態特征鑒定，鑒定菌株O5為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri），命名為Pseudomonas stutzeri O5。

圖4基于16S rRNA基因序列構建的系統發育樹

2.3β-甘露聚糖酶的酶學性質

 菌株在含有甘露聚糖的固體培養基上生長，被誘導產生β-甘露聚糖酶后，會將菌落周圍的多聚糖降解為寡糖，經過剛果紅染色后產酶菌株的菌落周圍就會產生清晰的透明圈，通過這種方法可以比較直觀的觀察菌株是否產β-甘露聚糖酶。但酶活力大小與透明圈的大小之間并不是嚴格的比例關系，故采用DNS法測定其產酶的酶活力大小。菌株O5在瓜爾膠固體培養基上生長，經剛果紅染色后產生了明顯的透明圈；且其只有在以甘露聚糖類物質為底物時才有還原糖的產生，以瓜爾膠為底物時，比活為347.4 U/mg，當以葡聚糖、果膠等為底物時，并沒有測到酶活力，由此確定菌株O5所產酶為β-甘露聚糖酶ME-O5（ME-O5）。

 溫度對酶活力的影響如圖5A所示。ME-O5的最適反應溫度為50℃。據報道，大多數β-甘露聚糖酶的最適溫度在40~65℃之間，低于或高于最適溫度下大多數酶均不穩定，但其失活的速率不同。ME-O5在20~70℃范圍內的相對酶活力均在80%以上，能夠保持較高的酶活力；當溫度超過70℃時，酶活力快速降低；當溫度小于20℃時，酶活力雖然有所下降，但相對酶活力仍保持在60%以上。值得注意的是，在5、10和20℃下ME-O5分別具有約60%、約72%和約80%的相對酶活力。由此可見，ME-O5的溫度作用范圍廣，低溫下酶活力高。

圖5溫度、pH值對β-甘露聚糖酶酶活力及穩定性的影響

 與已報道的一些低溫酶相比，ME-O5在低溫下能保持更高的相對酶活力。Zhou等從磷石礦渣中分離得到Sphingomonas sp.JB13，其所產的β-甘露聚糖酶的最適溫度為40℃，在20℃時的相對酶活力約為55%，在10℃時約為20%。Huang等分離到一株高產β-甘露聚糖酶的Bacillus subtilis Bs5，其所產酶的最適溫度為35℃，在20℃時能保持40%的相對酶活力。Pongsapipatana等從Klebsiella oxytoca KUB-CW2-3中克隆了β-甘露聚糖酶的編碼基因，并通過大腸桿菌系統表達，得到甘露聚糖酶KMAN-2，其最適溫度為30~50℃，在30℃時的相對酶活力約為60%。

 由圖5B可知，ME-O5在60℃熱處理1 h，其殘余酶活力保持在90%以上，具有良好的穩定性；但隨著溫度的升高，酶活力穩定性迅速下降，在70℃處理1 h，其酶活力保持在60%以上；當ME-O5在80℃時熱處理30 min，能保持高于50%的酶活力，隨著熱處理時間的增加，酶活力繼續下降，處理1 h時僅能維持大約20%的酶活力。由此可知，ME-O5在中溫區域的熱穩定性良好，但在高溫區域（80℃以上）的熱穩定性相對較差。

 圖5C是不同pH值條件下ME-O5的相對活性，結果表明，ME-O5的最適pH=7.0。當pH值在2.0~7.0時，隨著pH值增大，ME-O5的相對酶活力增加，在pH=2.0時仍能保持43%的相對酶活力；當pH值在7.0~12.0時，隨著pH值的繼續增大，ME-O5的相對酶活力逐漸降低。但pH值在3.0~9.0范圍內，ME-O5均能夠維持70%以上的酶活力，具有一定的pH值適應性和較寬的pH值耐受范圍。

 將ME-O5分別與不同pH值的緩沖液混合，在50℃下孵育2 h，再與瓜爾膠底物溶液在最適條件下反應，測定其殘余酶活力，結果如圖5D所示。由圖可知，ME-O5在pH值4.0~7.0范圍內處理2 h，其殘余酶活力均能保持在80%以上，說明該酶在弱酸條件下能夠保持較高的酶活力且相對穩定。當pH值在8.0~9.0之間時，處理2 h仍能保持65%以上的殘余酶活力，ME-O5的pH值穩定性良好。

2.4低溫條件下ME-O5對瓜爾膠的降解

 ME-O5對瓜爾膠的降粘結果如圖6所示。在20℃條件下，ME-O5可使粘度超過1000 mPa·s的瓜爾膠溶液在3 h內粘度降低至5 mPa·s以下，使其粘度降低99%以上，在降低瓜爾膠粘度上表現優異；在5℃時，雖然降粘速度有所下降，但仍可在3 h內將粘度超過1000 mPa·s的瓜爾膠溶液的粘度降至100 mPa·s以內，在6 h內粘度降低至5 mPa·s以下，而空白組中的瓜爾膠溶液仍保持高粘度。由此可知，ME-O5表現出優良的低溫降解瓜爾膠特性，能在短時間少用量的情況下，降解大量瓜爾膠底物，5℃時3 h內能使瓜爾膠溶液的粘度降低90%以上，降粘效果顯著。You等研究發現來源于Enterobacter sp.N18的β-甘露聚糖酶在40℃時，3 h內可以將粘度大于1000 mPa·s的壓裂液的粘度降低到5 mPa·s以下。Li等從Bacillus subtilis TD7中分離出一種低溫β-甘露聚糖酶（YBMan），并在大腸桿菌中成功表達，在20℃時YBMan能在3 h內將瓜爾膠溶液的粘度從500 mPa·s降低到5 mPa·s以下。相較而言，ME-O5在低溫下降解瓜爾膠更有優勢，因此在以瓜爾膠為稠化劑的壓裂液中，進一步探究ME-O5作為酶破膠劑的破膠性能。

圖6 5、20℃時瓜爾膠溶液的粘度變化

2.5 ME-O5的破膠效果

2.5.1 ME-O5與水基壓裂液添加劑的配伍性

 在壓裂過程中選擇生物酶作為破膠劑，必須要保證酶與不同壓裂液添加劑間的配伍性。按1.2.7小節中壓裂液配方，將ME-O5分別與只含有KCl、Na2CO3、NaHCO3、戊二醛、硼砂和瓜爾膠添加劑的瓜爾膠溶液混合，破膠3 h后測定其破膠液的粘度。ME-O5在不同壓裂液添加劑下的破膠情況如表2所示。由表2可知，各種壓裂液添加劑與ME-O5均沒有配伍禁忌，3 h后破膠液的粘度均下降至5 mPa·s以內，具有良好的配伍性。

表2 ME-O5與不同壓裂液添加劑的配伍性

 水基壓裂液是由多種不同的添加劑按比例配成的非均質不穩定化學體系。隨著壓裂技術的不斷發展，壓裂液體系也在不斷優化。在實際的壓裂施工中，水基壓裂液的配方由于施工環境的不同，存在著較大的差異。本壓裂液配方選擇油田中常用的瓜爾膠作為稠化劑；選擇硼砂作為交聯劑；為了穩定粘土礦物，選擇KCl作為粘土穩定劑，以減少粘土礦物等對儲層滲透率造成的傷害；為了使壓裂液的性能更加穩定，便于控制，還加入了一定量的Na2CO3和NaHCO3，作為pH調節劑。此外，從低成本的角度考慮，選擇戊二醛為殺菌劑，用來防止細菌滋生。

2.5.2粘度變化

 按照配方配置壓裂液，壓裂液凍膠初始粘度為大于1000 mPa·s，加入1%（體積分數）的ME-O5，在不同溫度下分別恒溫反應3和6 h后測得其破膠液的粘度如圖7所示。破膠3 h時，在10~60℃范圍內，ME-O5均可將壓裂液粘度降至5 mPa·s以下，徹底破膠（室溫測定破膠液粘度低于5 mPa·s時視為徹底破膠）；但當溫度在10℃以下或60℃以上時，酶的活性受到了影響，未能在3 h內破膠。當破膠時間延長到6 h時，在5~70℃內，壓裂液能徹底破膠。由此表明ME-O5的在中低溫范圍內破膠效果好，在很大程度上彌補了化學破膠劑的破膠效果在低溫時受到限制的問題。

圖7不同溫度下壓裂液粘度隨時間的變化

2.5.3表/界面張力及殘渣量

 在水力壓裂過程中，僅壓裂返排液的粘度低不能說明裂縫中的壓裂液已返排干凈，要綜合考慮其破膠性能。壓裂液在10、20和50℃條件下破膠3 h后，破膠液的表面張力、界面張力和殘渣量的測定結果如表3所示。由表中數據可知，無論是在10、20還是50℃條件下，破膠液的表面張力均小于28 mN/m，界面張力均小于2 mN/m，殘渣量均小于600 mg/L，達到或優于我國石油天然氣行業標準SY/T 6376-2008《壓裂液通用技術條件》的要求，SY/T 6376-2008中關于破膠性能的各項指標分別為：破膠時間≤720 min，破膠液表觀粘度≤5.0 mPa·s，破膠液表面張力≤28.0 mN/m，破膠液與煤油界面張力≤2.0 mN/m，殘渣量≤600 mg/L。這充分說明ME-O5在低溫下的破膠效果良好，在低溫油田壓裂破膠方面表現出巨大的應用潛力。

表3破膠液的評價

3、結論

 低溫酶破膠劑對頁巖油氣藏開發過程中返排液的破膠及低溫油藏壓裂液的破膠至關重要。為此，本研究從油田壓裂返排水和魔芋田地的混合樣品中成功篩選到一株產低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5，其所產β-甘露聚糖酶（ME-O5）的最適溫度為50℃，最適pH=7.0，對環境溫度和酸堿度的耐受范圍廣；在5~20℃時仍能保持約60%以上的酶活力，低溫活性優異。ME-O5與壓裂液各添加劑的配伍性良好，在10、20和50℃下均能徹底破膠，殘渣少，具有良好的低溫破膠性能。ME-O5作為酶破膠劑具有專一性強、溫度和pH作用范圍寬、低溫活性高等優點，彌補了化學破膠劑在低溫下破膠效果差的弊端，在低溫破膠領域有良好的應用潛力；且ME-O5可以快速降低壓裂返排液的粘度，減少對自然環境造成的污染，在頁巖油氣藏和致密油氣藏開發過程中具有重要的應用價值。

產低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——摘要

產低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——實驗部分

產低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——結果與討論、結論