經過一次、二次常規采油之后，遺留在地層的殘余油仍然占石油總量的60%～70%。如何最大限度地開采出地下剩余的原油，已經成為石油工業的重要任務。Zobell在1946年發表了利用微生物提高石油采收率的專利，并發現微生物提高石油采收率的機理之一是微生物代謝過程中產生了生物表面活性劑。產生表面活性劑的微生物種類很多，如酵母菌、真菌、細菌等。能以原油組分為碳源和能源產生生物表面活性劑的微生物，是微生物采油的首選菌種。現已知的能應用于微生物采油的菌種有近30個屬100多種。利用不同的培養基對不同的菌種進行培養、馴化，獲得了可以產生大量表面活性劑、對稠油具有較強的分散、乳化作用的菌種。從污水中分離到的一株地衣芽孢桿菌可以耐受高溫和高濃度鹽，且對原油具有較強的乳化、增溶和降黏作用。Ghojavand等在兼性厭氧條件下篩選出耐高溫(60℃)、高礦化度(15%NaCl)的枯草芽孢桿菌，該菌對原油具有較強的降黏作用。研究生物表面活性劑產生菌在微生物采油過程中的生長規律，探討其作用機理，對微生物采油技術的改進和完善具有十分重要的理論和實際意義。

 本研究通過原油平板培養法，篩選出3株生物表面活性劑產生菌，對各菌株進行生理生化試驗和初步鑒定；測定各菌株在發酵過程中發酵液表面張力、pH、菌體密度和細胞疏水性等特征參數；對各菌株產生的生物表面活性劑組成進行分析。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌源

盤錦油田被原油污染的土壤。

1.2方法

1.2.1培養基及其制備方法

 液體富集培養基(g/L)：原油3.0，NaCl 3.0，NH4Cl 0.1，MgSO40.02，NaNO30.2，KH2PO40.1，K2HPO40.2，pH 7.0。于1.03×105Pa滅菌30 min。

 平板富集培養基(g/L)：原油3.0，蛋白胨5.0，瓊脂20.0，NaCl 3.0，NH4Cl 0.1，MgSO40.02，NaNO30.2，KH2PO40.1，K2HPO40.2，pH 7.0。于1.03×105Pa滅菌30 min。

 平板分離及保藏培養基(g/L)：葡萄糖3.0，蛋白胨8.0，酵母膏3.0，KH2PO42.7，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.0。于0.8×105Pa滅菌30 min。

 種子培養基(g/L)：NaCl 5.0，牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，pH 7.0，于1.03×105Pa滅菌30 min。

 發酵培養基(g/L)：KH2PO43.4，Na2HPO41.5，(NH4)2SO44.0，MgSO4·7H2O 0.7，酵母粉0.2，液體石蠟17，pH 7.0，于1.03×105Pa滅菌30 min。

1.2.2菌源微生物的富集

 稱取土樣10 g，加入生理鹽水90 mL，振蕩均勻，靜止12 h。取上清液按10%接種量接種到液體富集培養基中，于30℃、180 r/min的恒溫搖床中振蕩培養3 d。連續轉接培養3次。

1.2.3生物表面活性劑產生菌的分離、篩選與鑒定

 生物表面活性劑產生菌的分離、初篩：將液體富集培養液用無菌生理鹽水稀釋105、106、107倍，每個稀釋度取0.1 mL菌液涂布于平板富集培養基上，于30℃靜置培養4 d。將平板富集培養基上有乳化圈或噬油斑的菌落，進一步在平板分離培養基上劃線分離純化，挑取單菌落保藏在斜面保藏培養基上。

 生物表面活性劑產生菌的復篩：將斜面保存的初篩菌株接種在種子培養基中，于30℃、180 r/min振蕩培養1～3 d，再以體積分數為5%的接種量將種子培養液接于液體發酵培養基，于30℃、180 r/min振蕩培養。根據液體石蠟被乳化及發酵液表面張力的變化，篩選出產生物表面活性劑的優勢菌株。

 生物表面活性劑產生菌的鑒定：根據《伯杰氏(Berge)菌種鑒定手冊》對分離得到的部分菌株進行形態觀察和生理生化鑒定。

1.2.4生物表面活性劑提取與分析

1.2.4.1生物表面活性劑的提取

 將發酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液加入等體積的氯仿和甲醇(體積比為2∶1)的混合液，萃取3次。將萃取后的有機相于40℃旋轉蒸發得表面活性劑粗品。

1.2.4.2生物表面活性劑的化學組成分析

 將發酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液加入等體積氯仿和甲醇(體積比為2∶1)萃取所得有機相進行薄層層析。以氯仿、甲醇和水(體積比為65∶15∶2)為展開劑，以苯酚-硫酸試劑為顯色劑，顯棕色斑點為糖脂；以茚三酮試劑為顯色劑，顯紅色斑點為脂肽。

 取150 mg樣品加入2 mol/L H2SO4，于100℃密封水解8 h，用BaCO3中和至中性，3 000g離心10 min，取上清液進行薄層層析。以氯仿、甲醇和水(體積比為65∶15∶2)為展開劑，以苯酚-硫酸試劑為顯色劑，以鼠李糖為標準樣品。

薄層層析用硅膠板為德國Merck公司產品silica gel 60 F254。

1.2.5生物表面活性劑產生菌的生長特性

 菌體密度的測定：采用濁度法。移除發酵液上層油相，取發酵液3 mL，加入TritonX-100(0.2%)溶液0.5 mL，漩渦振蕩1 min，于3 000g離心20 min，倒掉上清液，用3 mL去離子水重懸菌體，以去離子水為空白，于600 nm測定菌懸液的光密度OD600，以此表示發酵液的菌體密度。

 疏水性(BATH)測定：采用BATH測定方法。移除發酵液上層油相，取發酵液3 mL，測定OD′600。加入石油醚0.1 mL，振蕩1 min，靜置30 s，再振蕩1 min，于30℃水中靜置15 min，取下層液體測定OD600。細胞疏水性BATH=OD600/OD′600。

表面張力測定：采用表面張力儀(芬蘭Kibron公司)測定。將發酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液測定表面張力。

 pH測定：采用pH3-3C精密pH計測定。將發酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液測定pH。

生物表面活性劑產生菌菌體密度、細胞疏水性與發酵液pH及表面張力的關系（一）

生物表面活性劑產生菌菌體密度、細胞疏水性與發酵液pH及表面張力的關系（二）