1.3生物表面(mian)活性劑的特性分析

1.3.1生物表面活(huo)性劑的制備

將菌株XH-2在(zai)優化后的(de)培養基(ji)中發酵(jiao)培養60h，經紗(sha)布初過濾的(de)發酵(jiao)液(ye)(ye)在(zai)4℃、10 000r·min-1下離(li)心20min，取(qu)上(shang)清(qing)液(ye)(ye)用(yong)6mol·L-1HCl溶液(ye)(ye)調節(jie)pH值(zhi)至2.0，用(yong)等體積的(de)乙酸乙酯(zhi)溶液(ye)(ye)萃(cui)取(qu)2次，合并有機相于旋轉蒸發儀(yi)上(shang)濃(nong)縮，將濃(nong)縮液(ye)(ye)倒入燒杯中，待自然(ran)揮發干(gan)后即得生(sheng)物表面活(huo)性劑(ji)粗品(pin)。

1.3.2生物表面(mian)活性(xing)劑對溫(wen)度、pH值(zhi)和鹽度的(de)耐(nai)受性(xing)

將生物(wu)表面活性(xing)劑粗品配制成濃度為0.3g·L-1的溶液，分別在4℃、室溫、60℃、100℃條件下(xia)處理30min，冷卻至室溫，測(ce)定其表面張力(li)。

用(yong)1mol·L-1HCl溶(rong)液(ye)或(huo)1mol·L-1NaOH溶(rong)液(ye)調節(jie)生物表面(mian)活性劑溶(rong)液(ye)的pH值(zhi)分別為2、4、6、8、10、12，均于室溫(wen)下放置12h，測定(ding)其表面(mian)張力。

加(jia)入(ru)適(shi)量(liang)氯化鈉(na)使(shi)生物表面活(huo)性劑溶液的鹽度分別為0%、1%、3%、5%、7%、9%，均于室溫下放置12h，測定其表面張力(li)。

1.3.3臨界膠束濃度(CMC)的測定

用蒸餾水將(jiang)生物表(biao)面活性劑(ji)粗品配制成不同濃度(du)的溶液，在室溫下測定(ding)其(qi)表(biao)面張(zhang)力(li)(li)。根據(ju)生物表(biao)面活性劑(ji)濃度(du)與表(biao)面張(zhang)力(li)(li)的變(bian)化曲線(xian)圖(tu)得出臨界膠束濃度(du)。

1.3.4生物表面活性(xing)劑成分的(de)初步鑒定

表(biao)(biao)(biao)面(mian)活(huo)性(xing)(xing)劑(ji)(ji)的鑒(jian)定(ding)：采(cai)用亞甲基(ji)藍-氯(lv)仿實驗。將生(sheng)物表(biao)(biao)(biao)面(mian)活(huo)性(xing)(xing)劑(ji)(ji)粗品(pin)配(pei)制成濃度為0.3 g·L-1的溶液，取5 mL表(biao)(biao)(biao)面(mian)活(huo)性(xing)(xing)劑(ji)(ji)溶液，依次加入(ru)10 mL亞甲基(ji)藍和5 mL氯(lv)仿，充分混勻，靜置(zhi)幾(ji)分鐘后(hou)觀察其顏(yan)色(se)(se)(se)。若(ruo)氯(lv)仿層(ceng)顏(yan)色(se)(se)(se)變深，而水層(ceng)幾(ji)乎無色(se)(se)(se)，表(biao)(biao)(biao)明樣(yang)品(pin)屬于(yu)陰離(li)子(zi)型(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)面(mian)活(huo)性(xing)(xing)劑(ji)(ji)；若(ruo)水層(ceng)顏(yan)色(se)(se)(se)變深，而氯(lv)仿層(ceng)幾(ji)乎無色(se)(se)(se)，表(biao)(biao)(biao)明樣(yang)品(pin)屬于(yu)陽離(li)子(zi)型(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)面(mian)活(huo)性(xing)(xing)劑(ji)(ji)；若(ruo)兩層(ceng)顏(yan)色(se)(se)(se)大致相(xiang)同，且水層(ceng)呈乳(ru)液狀(zhuang)，表(biao)(biao)(biao)明樣(yang)品(pin)屬于(yu)非離(li)子(zi)型(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)面(mian)活(huo)性(xing)(xing)劑(ji)(ji)。

定性分析：將生(sheng)物表(biao)(biao)面活(huo)性劑粗品配制成一定濃度的溶(rong)液，用1 mol·L-1HCl溶(rong)液調節pH值到2左右，于4℃靜置(zhi)過(guo)夜，觀察現(xian)象。若(ruo)產(chan)(chan)生(sheng)白(bai)色沉淀，表(biao)(biao)明(ming)其為脂肽(tai)或脂蛋白(bai)類(lei)表(biao)(biao)面活(huo)性劑；若(ruo)沒有白(bai)色沉淀產(chan)(chan)生(sheng)，表(biao)(biao)明(ming)其為糖脂類(lei)表(biao)(biao)面活(huo)性劑。

紅外(wai)(wai)光(guang)譜(FTIR)分析：將生物表(biao)面活性劑(ji)粗品用KBr壓片法進行紅外(wai)(wai)光(guang)譜分析。

2結果與討論

2.1不同碳、氮源(yuan)對(dui)菌株(zhu)XH-2產生物表面活性劑的影響(圖1)

圖1碳(tan)、氮源對菌株XH-2產(chan)生物(wu)表面(mian)活性劑的影響

由圖1a可知(zhi)，菌株(zhu)XH-2以柴(chai)油(you)(you)(you)(you)為(wei)(wei)碳源(yuan)時(shi)，發酵液的(de)排(pai)(pai)油(you)(you)(you)(you)圈直徑為(wei)(wei)0；以泔水(shui)(shui)油(you)(you)(you)(you)為(wei)(wei)碳源(yuan)時(shi)，排(pai)(pai)油(you)(you)(you)(you)圈直徑最大(5.1 cm)，相(xiang)對應的(de)表面張力(li)最小(31.1 mN·m-1)。相(xiang)較于葡萄糖、淀(dian)粉、甘(gan)油(you)(you)(you)(you)這些常用(yong)碳源(yuan)，泔水(shui)(shui)油(you)(you)(you)(you)用(yong)作(zuo)產(chan)生(sheng)物表面活(huo)性(xing)劑(ji)的(de)原料(liao)(liao)尚未見報(bao)道。以泔水(shui)(shui)油(you)(you)(you)(you)為(wei)(wei)原料(liao)(liao)生(sheng)產(chan)生(sheng)物表面活(huo)性(xing)劑(ji)，既能(neng)廢(fei)物利(li)用(yong)，又節能(neng)環保，具有顯著的(de)現實意義。由圖1b可知(zhi)，當(dang)泔水(shui)(shui)油(you)(you)(you)(you)濃度為(wei)(wei)3%時(shi)，表面張力(li)最小(30.49 mN·m-1)，排(pai)(pai)油(you)(you)(you)(you)圈直徑最大(4.8 cm)。因(yin)此，確定最適碳源(yuan)為(wei)(wei)3%泔水(shui)(shui)油(you)(you)(you)(you)。

由圖1c可(ke)知(zhi)，以豆粕為(wei)氮源時，發(fa)酵液的(de)表(biao)面張力(li)(li)最(zui)小(xiao)(29.69 mN·m-1)，相(xiang)對應的(de)排(pai)油(you)圈直(zhi)徑(jing)最(zui)大(da)(6.1 cm)；當采用無機氮源尿素(su)和(he)硫酸銨時，雖然發(fa)酵液的(de)表(biao)面張力(li)(li)較小(xiao)，分(fen)別為(wei)30.62 mN·m-1和(he)30.56 mN·m-1，但相(xiang)對應的(de)排(pai)油(you)圈直(zhi)徑(jing)也小(xiao)，分(fen)別為(wei)3.75 cm和(he)3.25 cm。已有(you)利用無機氮源(如氯(lv)化(hua)銨、硝(xiao)酸鈉(na)等(deng))進行(xing)發(fa)酵生產生物(wu)表(biao)面活性劑的(de)相(xiang)關(guan)報道(dao)，而在本(ben)研(yan)究中(zhong)最(zui)適(shi)的(de)氮源是豆粕。由圖1d可(ke)知(zhi)，隨著豆粕濃度(du)的(de)增大(da)，排(pai)油(you)圈直(zhi)徑(jing)增大(da)，在豆粕濃度(du)為(wei)5%時，排(pai)油(you)圈直(zhi)徑(jing)達(da)到(dao)最(zui)大(da)(6.75 cm)，表(biao)面張力(li)(li)最(zui)小(xiao)(25.83 mN·m-1)。因此，確定最(zui)適(shi)氮源為(wei)5%豆粕。

2.2最佳接種(zhong)量(liang)、鹽度、初始(shi)pH值的確定(圖(tu)2)

接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)量(liang)影響微生物(wu)(wu)所產生物(wu)(wu)表(biao)面(mian)(mian)活(huo)性(xing)劑的(de)(de)產量(liang)。接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)量(liang)過大，培(pei)養液中(zhong)細(xi)菌的(de)(de)初始濃度(du)(du)高，過量(liang)的(de)(de)菌體在生長(chang)過程中(zhong)因(yin)消(xiao)耗大量(liang)的(de)(de)營養底物(wu)(wu)而使(shi)生物(wu)(wu)表(biao)面(mian)(mian)活(huo)性(xing)劑的(de)(de)產量(liang)降低(di)；接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)量(liang)過小(xiao)，培(pei)養液中(zhong)菌體濃度(du)(du)低(di)，培(pei)養周期(qi)延長(chang)。由(you)圖2a可(ke)知，在接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)量(liang)為(wei)4%時，表(biao)面(mian)(mian)張力最小(xiao)(30.39 mN·m-1)，相對應的(de)(de)排油圈直徑最大(5.25 cm)；接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)量(liang)超過4%后，表(biao)面(mian)(mian)張力增大。因(yin)此，確定最佳接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)量(liang)為(wei)4%。

圖2接種(zhong)量(a)、鹽度(du)(b)和初始(shi)pH值(c)對(dui)菌株(zhu)XH-2產生物表面(mian)活(huo)性(xing)劑的影響

鹽(yan)(yan)度(du)調節細(xi)胞內外的滲透壓，影響(xiang)微(wei)生(sheng)物的新陳(chen)代(dai)謝和酶(mei)的活(huo)性(xing)，鹽(yan)(yan)度(du)過(guo)高或(huo)過(guo)低都會對微(wei)生(sheng)物的新陳(chen)代(dai)謝產(chan)生(sheng)不利影響(xiang)。由圖2b可知，鹽(yan)(yan)度(du)為2%時，表面(mian)張(zhang)力最小(25.75 mN·m-1)，排油圈直徑最大(7.25 cm)；而鹽(yan)(yan)度(du)低于或(huo)高于2%時，發(fa)酵液的表面(mian)張(zhang)力增大，排油圈直徑減小。因此，確(que)定菌株XH-2產(chan)生(sheng)物表面(mian)活(huo)性(xing)劑的最適鹽(yan)(yan)度(du)為2%。

微生(sheng)(sheng)物的(de)生(sheng)(sheng)命代(dai)謝活動與環境的(de)pH值(zhi)(zhi)密切相(xiang)關。微生(sheng)(sheng)物機體內的(de)生(sheng)(sheng)物化(hua)學反(fan)應(ying)一(yi)般是酶促反(fan)應(ying)，參(can)與反(fan)應(ying)的(de)酶都有(you)其相(xiang)應(ying)的(de)最(zui)適pH值(zhi)(zhi)范圍(wei)，一(yi)般認為pH值(zhi)(zhi)6.5～8.5有(you)利于微生(sheng)(sheng)物產生(sheng)(sheng)物表(biao)面(mian)活性劑。由圖(tu)2c可(ke)知，菌株(zhu)XH-2在(zai)初(chu)始(shi)pH值(zhi)(zhi)5.0～10.0范圍(wei)內，其表(biao)面(mian)張(zhang)力(li)基(ji)本上是先(xian)減小(xiao)后增大。當(dang)初(chu)始(shi)pH值(zhi)(zhi)為6.0時(shi)，發(fa)酵(jiao)液的(de)排油圈直徑最(zui)大(7.1 cm)，表(biao)面(mian)張(zhang)力(li)最(zui)小(xiao)(25.25 mN·m-1)；當(dang)初(chu)始(shi)pH值(zhi)(zhi)為10.0時(shi)，發(fa)酵(jiao)液的(de)排油圈直徑最(zui)小(xiao)(5.2 cm)，表(biao)面(mian)張(zhang)力(li)為26.91 mN·m-1。因此，確定(ding)菌株(zhu)XH-2產生(sheng)(sheng)物表(biao)面(mian)活性劑發(fa)酵(jiao)培(pei)養基(ji)的(de)最(zui)適初(chu)始(shi)pH值(zhi)(zhi)為6.0。