摘要

底物特異性是表(biao)征(zheng)酶(mei)的(de)(de)(de)一個關鍵(jian)參數，它直接關系到酶(mei)的(de)(de)(de)應(ying)用(yong)潛力。商品化的(de)(de)(de)Lecitase Ultra已(yi)被廣泛(fan)用(yong)于石油(you)脫膠過(guo)程(cheng)中(zhong)，以(yi)特異性水解(jie)原(yuan)油(you)中(zhong)的(de)(de)(de)磷(lin)(lin)脂，但其對(dui)各種(zhong)(zhong)磷(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)特異性仍不(bu)清楚。在(zai)(zai)本研(yan)究(jiu)中(zhong)，采用(yong)單(dan)層技術，在(zai)(zai)不(bu)同的(de)(de)(de)表(biao)面壓力條件下(xia)表(biao)征(zheng)了(le)(le)超乳糖酸(suan)酶(mei)對(dui)不(bu)同種(zhong)(zhong)類(lei)磷(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)選擇性。超乳糖酸(suan)酶(mei)對(dui)各種(zhong)(zhong)磷(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)水解(jie)活(huo)性高度(du)依賴于單(dan)層膜的(de)(de)(de)表(biao)面壓力。在(zai)(zai)相同的(de)(de)(de)表(biao)面壓力（25mN/m）下(xia)，在(zai)(zai)所(suo)有磷(lin)(lin)脂單(dan)層膜的(de)(de)(de)液體冷凝狀(zhuang)態(tai)下(xia)，超卵磷(lin)(lin)脂酶(mei)對(dui)不(bu)同單(dan)分子磷(lin)(lin)脂膜的(de)(de)(de)偏(pian)好(hao)順序為PE>CL>PS>PI>PC。在(zai)(zai)測試(shi)的(de)(de)(de)表(biao)面壓力范(fan)圍內，未觀(guan)察到鞘磷(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)水解(jie)活(huo)性。目前的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)提(ti)(ti)供了(le)(le)關于Lecitase Ultra對(dui)各種(zhong)(zhong)磷(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)選擇性偏(pian)好(hao)順序的(de)(de)(de)基本信(xin)息，這是以(yi)前未知的(de)(de)(de)，并為更好(hao)地利用(yong)這種(zhong)(zhong)酶(mei)在(zai)(zai)石油(you)工業(ye)中(zhong)提(ti)(ti)供了(le)(le)額(e)外(wai)的(de)(de)(de)信(xin)息。

實際應用

據我們(men)所知(zhi)，我們(men)已經報道了(le)應用單(dan)(dan)(dan)層(ceng)技(ji)術研(yan)究(jiu)超乳糖酸酶(mei)對各種天然磷脂(zhi)的(de)底物選擇性。這(zhe)項研(yan)究(jiu)直(zhi)接有(you)助于(yu)該酶(mei)在工業中(zhong)的(de)應用。此外，我們(men)試圖證(zheng)明單(dan)(dan)(dan)層(ceng)技(ji)術對于(yu)評估某些天然底物的(de)酶(mei)活性是非(fei)常有(you)效(xiao)和(he)簡單(dan)(dan)(dan)的(de)，并且應該在界面酶(mei)工程領域做出更大(da)的(de)貢(gong)獻。

圖形摘要

利(li)用單層(ceng)技(ji)術表征超乳糖酸酶對不(bu)同磷脂的界面(mian)催(cui)化(hua)性能(neng)。

1、介紹

Lecitase Ultra是(shi)藍綠假(jia)單胞(bao)菌脂(zhi)(zhi)肪酶(mei)(mei)(mei)（TLL）和(he)尖(jian)孢鐮(lian)刀菌脂(zhi)(zhi)肪酶(mei)(mei)(mei)（FOL）的(de)嵌合體[1]，具有相(xiang)當高的(de)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酶(mei)(mei)(mei)活(huo)性(xing)(xing)和(he)脂(zhi)(zhi)肪酶(mei)(mei)(mei)活(huo)性(xing)(xing)[2]。這(zhe)種(zhong)酶(mei)(mei)(mei)完全基于其磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酶(mei)(mei)(mei)活(huo)性(xing)(xing)，能夠(gou)水解油中(zhong)的(de)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)，并通過形(xing)成溶血磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)和(he)甘油磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)將其去(qu)除，從(cong)而成功地用(yong)于植物油的(de)脫膠(jiao)[3,4]。正如我們所知，不(bu)(bu)同來(lai)源(yuan)的(de)原(yuan)油中(zhong)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)的(de)組成和(he)含(han)量存在顯(xian)著差異(yi)：例如，原(yuan)油中(zhong)的(de)卵磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)通常(chang)含(han)有20%的(de)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)膽(dan)堿（PC）、15%的(de)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)乙醇胺（PE）、20%的(de)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)肌醇（PI）、5%的(de)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酸（PA）和(he)其他磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)[5]。因此，Lecitase Ultra對不(bu)(bu)同磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)的(de)選擇(ze)性(xing)(xing)是(shi)實際應(ying)用(yong)中(zhong)的(de)一(yi)個重要參考指標，這(zhe)反過來(lai)又與應(ying)添(tian)加的(de)酶(mei)(mei)(mei)量以及脫膠(jiao)過程中(zhong)所需的(de)反應(ying)時間直接(jie)相(xiang)關。因此，獲(huo)得(de)這(zhe)種(zhong)酶(mei)(mei)(mei)對天然(ran)(ran)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)的(de)選擇(ze)性(xing)(xing)信息尤為(wei)重要。然(ran)(ran)而，仍然(ran)(ran)缺乏對這(zhe)方(fang)面的(de)深入了解。

脂(zhi)肪酶作為一(yi)種界(jie)(jie)面酶，催化(hua)不溶性(xing)(xing)底物(wu)與水之(zhi)間(jian)的(de)界(jie)(jie)面水解(jie)反應[6]。因此，脂(zhi)肪分解(jie)的(de)催化(hua)反應與各種界(jie)(jie)面現象有關，并強(qiang)烈(lie)依賴于界(jie)(jie)面上存在(zai)的(de)脂(zhi)質(zhi)基質(zhi)的(de)結(jie)構組織(zhi)[6-8]。為了獲(huo)得有關酶對(dui)各種磷脂(zhi)選擇性(xing)(xing)的(de)適當信息，選擇合適的(de)測試方法至關重要(yao)，應該(gai)是(shi)首要(yao)考慮的(de)問題。

單(dan)(dan)層技(ji)術(shu)是(shi)研究(jiu)空(kong)氣/水界面(mian)(mian)上酶(mei)(mei)(mei)-脂(zhi)質(zhi)(zhi)相(xiang)(xiang)互作(zuo)用(yong)的(de)(de)(de)(de)最通用(yong)的(de)(de)(de)(de)實(shi)驗系統，已(yi)被(bei)用(yong)于通過(guo)相(xiang)(xiang)對表(biao)面(mian)(mian)活性(xing)來(lai)比較脂(zhi)肪(fang)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)底物選擇性(xing)[9]。使用(yong)單(dan)(dan)層技(ji)術(shu)進(jin)行酶(mei)(mei)(mei)表(biao)征有幾(ji)個優點。首先，底物和(he)酶(mei)(mei)(mei)只需要(yao)少量(liang)的(de)(de)(de)(de)物質(zhi)(zhi)。因(yin)此，我們可以(yi)(yi)(yi)以(yi)(yi)(yi)非常(chang)低的(de)(de)(de)(de)成本獲得酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)活性(xing)信息。其次，可以(yi)(yi)(yi)改變表(biao)面(mian)(mian)組(zu)分的(de)(de)(de)(de)分子(zi)(zi)(zi)堆積，并(bing)(bing)且(qie)可以(yi)(yi)(yi)連續監(jian)測脂(zhi)質(zhi)(zhi)或(huo)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)從界面(mian)(mian)的(de)(de)(de)(de)釋放或(huo)轉移到(dao)(dao)界面(mian)(mian)的(de)(de)(de)(de)情況。第三(san)，與傳統的(de)(de)(de)(de)pH-stat方法(fa)(fa)相(xiang)(xiang)比，該方法(fa)(fa)的(de)(de)(de)(de)高靈敏度(du)(du)已(yi)通過(guo)實(shi)驗得到(dao)(dao)驗證[10,11]。最后，反(fan)應的(de)(de)(de)(de)物理化學參數，如溫度(du)(du)、側壓、分子(zi)(zi)(zi)密度(du)(du)、離子(zi)(zi)(zi)條件等(deng)，可以(yi)(yi)(yi)在很寬的(de)(de)(de)(de)范圍(wei)內方便地改變，并(bing)(bing)且(qie)可以(yi)(yi)(yi)以(yi)(yi)(yi)?精度(du)(du)分析結構[12]。因(yin)此，單(dan)(dan)分子(zi)(zi)(zi)層是(shi)研究(jiu)界面(mian)(mian)酶(mei)(mei)(mei)反(fan)應的(de)(de)(de)(de)合適模型。到(dao)(dao)目前(qian)為止，不同種(zhong)類的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)肪(fang)酶(mei)(mei)(mei)，甚至磷脂(zhi)酶(mei)(mei)(mei)（包括磷脂(zhi)酶(mei)(mei)(mei)A2、C和(he)D）已(yi)經通過(guo)使用(yong)這(zhe)種(zhong)方法(fa)(fa)進(jin)行了(le)表(biao)征[11-14]。

  本(ben)文首次采(cai)用單層技術對(dui)商品化超(chao)乳糖酸酶(mei)的底物(wu)(wu)選擇性進(jin)行(xing)了(le)表征。目前的結果(guo)不僅(jin)提供了(le)對(dui)酶(mei)底物(wu)(wu)選擇性的透徹理解，而且為酶(mei)在石油工業中的具體(ti)用途提供了(le)詳細信(xin)息。

2、材料和方法

2.1材料

商業Lecitase Ultra由(you)丹麥巴(ba)格斯瓦爾德(de)諾維信A/S提供，直(zhi)接測試，無需進一(yi)步純(chun)化。L-α-磷脂(zhi)酰(xian)肌醇（PI，純(chun)度(du)(du)≥1,2-二(er)酰(xian)基-sn-甘(gan)油(you)-3-磷酸-L-絲氨酸（PS，純(chun)度(du)(du)≥97%），L-α-磷脂(zhi)酰(xian)乙(yi)醇胺（PE，純(chun)度(du)(du)≥1,2-二(er)油(you)基-sn-甘(gan)油(you)-3-磷酸膽堿（PC，純(chun)度(du)(du)≥97%），心磷脂(zhi)（CL，純(chun)度(du)(du)）≥鞘磷脂(zhi)（SM，純(chun)度(du)(du)）≥98%）和(he)β-環(huan)糊精從Sigma-Aldrich（密蘇里(li)州圣路易斯）購買(mai)。HPLC級(ji)氯仿(fang)購自凱美爾化學試劑有(you)限公(gong)司（天津(jin)）。使用Millipore（馬薩諸塞州貝德(de)福(fu)德(de)）Milli-Q水(shui)系統凈化水(shui)。所(suo)有(you)其(qi)他攝政王都是分(fen)析(xi)級(ji)的。

2.2單分子薄膜實驗

2.2.1表面壓力-面積等溫線

使(shi)用帶(dai)有Langmuir-Teflon槽（206 mm×59 mm）的(de)(de)(de)商用單層(ceng)系統（芬蘭(lan)赫爾(er)辛基(ji)Kibron的(de)(de)(de)微槽X）和(he)兩個屏(ping)障的(de)(de)(de)對稱壓(ya)縮(suo)(suo)(suo)，記錄不(bu)同(tong)磷脂單層(ceng)的(de)(de)(de)壓(ya)縮(suo)(suo)(suo)等(deng)(deng)溫(wen)線(xian)。實驗在(zai)室溫(wen)（25℃）下進行。通過(guo)使(shi)用microsyringe（Hamilton Co.，Reno，NV）將不(bu)同(tong)磷脂的(de)(de)(de)氯仿儲(chu)備溶液(ye)滴在(zai)50 mM檸檬(meng)酸緩沖(chong)液(ye)（pH 5.0）亞(ya)相上(shang)形成單層(ceng)（Hamilton Co.，Reno，NV）。15分鐘后，以2.5 mm/min的(de)(de)(de)速率(lv)連(lian)續壓(ya)縮(suo)(suo)(suo)所需(xu)組(zu)合(he)物的(de)(de)(de)單層(ceng)。表面(mian)(mian)壓(ya)力(li)(li)是用附著在(zai)表面(mian)(mian)的(de)(de)(de)金屬絲探針測量(liang)的(de)(de)(de)。連(lian)續記錄表面(mian)(mian)壓(ya)力(li)(li)與(yu)表面(mian)(mian)積(ji)（π-A）等(deng)(deng)溫(wen)線(xian)。只(zhi)要需(xu)要，膠片就被壓(ya)縮(suo)(suo)(suo)到崩潰壓(ya)力(li)(li)。每(mei)次運行重復三次，保(bao)持π-A等(deng)(deng)溫(wen)線(xian)的(de)(de)(de)標準偏差小于4?2。

2.2.2使用一個"零(ling)級(ji)"槽(cao)（由(you)一個圓(yuan)形反(fan)應(ying)室(shi)(shi)和兩個儲(chu)液室(shi)(shi)（182mm×40mm）組成）進行了(le)Lecitase Ultra的(de)動力學水解(jie)(jie)活(huo)性(xing)計算。反(fan)應(ying)室(shi)(shi)的(de)直徑為21 mm，面(mian)積為346 mm2。這(zhe)兩種隔室(shi)(shi)通(tong)過一個小(xiao)的(de)表面(mian)通(tong)道(dao)（寬0.5厘米）相(xiang)互連接。該方法(fa)的(de)原理之前由(you)Verger和De Haas[15]描述(shu)。在(zai)(zai)目前的(de)工作中(zhong)，用毫Q水制備(bei)50 mM檸(ning)檬(meng)酸緩(huan)沖(chong)液（pH 5.0），并通(tong)過0.45μm微(wei)孔膜(mo)過濾。在(zai)(zai)50 mM檸(ning)檬(meng)酸緩(huan)沖(chong)液（pH 5.0）亞(ya)相(xiang)上涂抹幾(ji)微(wei)升氯仿磷脂(zhi)溶液，直到達到所需的(de)初始(shi)表面(mian)壓力（πi），制備(bei)單(dan)層。由(you)恒壓器(qi)自動驅動的(de)移動式(shi)屏障在(zai)(zai)儲(chu)層上來回移動，以壓縮并保持表面(mian)壓力（π）恒定。為了(le)確保水解(jie)(jie)反(fan)應(ying)中(zhong)產生的(de)長鏈(lian)脂(zhi)肪酸能(neng)夠溶解(jie)(jie)在(zai)(zai)水中(zhong)，按照Mosbah等人的(de)建議，將β-環糊精（0.6 mg/ml）注(zhu)入反(fan)應(ying)室(shi)(shi)。[10]。然后將10μL酶(mei)溶液注(zhu)入反(fan)應(ying)室(shi)(shi)的(de)亞(ya)相(xiang)以開始(shi)反(fan)應(ying)。如(ru)前所述(shu)，對數據進行了(le)相(xiang)應(ying)的(de)分析[15,16]。活(huo)性(xing)顯示為單(dan)位時(shi)間、單(dan)位反(fan)應(ying)室(shi)(shi)面(mian)積和"零(ling)級(ji)"槽(cao)中(zhong)每毫升酶(mei)水解(jie)(jie)的(de)底物摩爾數（摩爾數cm-2.min-1.mL-1）。所有分析測定均一式(shi)三份進行。結果以平(ping)均標準偏差（SD）的(de)形式(shi)清(qing)楚地呈現。